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Equine Herpesvirus 5 (EHV-5)馬皰疹病毒5型染料法熒光定量PCR試劑盒應(yīng)用

更新時(shí)間:2025-07-11      點(diǎn)擊次數(shù):35

背景:皰疹病毒(herpes virus)是一群有包膜的DNA病毒,生物學(xué)特性相似,歸類為皰疹病毒科(Herpesviridae)。其感染宿主廣泛,主要侵害皮膚、黏膜以及神經(jīng)組織,嚴(yán)重影響著人及其他動(dòng)物的健康。馬可能感染多種皰疹病毒。最常見的與感冒病毒相似,易致呼吸困難。馬皰疹病毒4型(EHV-4)也稱馬鼻肺炎病毒,主要引起呼吸系統(tǒng)疾病。因此靈敏快捷的診斷產(chǎn)品具有重要的意義。

產(chǎn)品及特點(diǎn)    

產(chǎn)品是根據(jù)探針法熒光定量 PCR 原理開發(fā)的檢測(cè)試劑盒,它具有下列特點(diǎn):

1. 即開即用,用戶只需要提供樣品 DNA 模板。

2. 引物等組分經(jīng)過優(yōu)化,靈敏度高。

3. 提供陽性對(duì)照,便于區(qū)分假陰性樣品。

4. 特異性高,引物是根據(jù)中間普雷沃菌 DNA 序列高度保守區(qū)設(shè)計(jì),不會(huì)跟其他生物樣本的DNA發(fā)生交叉反應(yīng)。

5. 既可用于定性檢測(cè),又可用于定量檢測(cè)。用于定量檢測(cè)時(shí)線性范圍至少為5個(gè)數(shù)量級(jí)。

6. 本產(chǎn)品足夠 50 次 20μL 體系的探針法熒光定量 PCR 反應(yīng)。

7. 本產(chǎn)品只能用于科研

PCR試劑盒.png

使用方法:

一、DNA 提取(樣本制備區(qū))

用自選方法提取純化樣品DNA,本試劑盒跟市場(chǎng)上大多數(shù)核酸提取試劑盒兼容。

二、稀釋標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品(樣本制備區(qū))

 (由于陽性對(duì)照濃度高,因此下列稀釋操作一定要在獨(dú)立的區(qū)域進(jìn)行,避免污染樣品或本試劑盒的其他成分)。

1. 標(biāo)記6個(gè)離心管,分別為7,6,5,4,3,2。

2.用帶芯槍頭分別加入45 μL DEPC-H2O,(最好用帶芯槍頭,下同)。

3.在7號(hào)管中加入5 μL 1×10E8拷貝/μL 的陽性對(duì)照(試劑盒提供),充分震蕩1分鐘,得1×10E7拷貝/μL的標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品。放冰上待用。

4.換槍頭,在6號(hào)管中加入5 μL 1×10E7拷貝/μL 的陽性對(duì)照(上步稀釋所得),充分震蕩1分鐘,得1×10E6拷貝/μL的標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品。放冰上待用。

5.換槍頭,在5號(hào)管中加入5 μL 1×10E6拷貝/μL 的陽性對(duì)照(上步稀釋所得),充分震蕩1分鐘,得1×10E5拷貝/μL的標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品。放冰上待用。

6.重復(fù)上面的操作直到得到6個(gè)稀釋度的標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品。放冰上待用。

若無需制作標(biāo)準(zhǔn)曲線,將陽性對(duì)照稀釋到1×10E5拷貝/μL即可。

三、試劑配制(試劑準(zhǔn)備區(qū))

若有N個(gè)待檢樣品,準(zhǔn)備N+2個(gè)qPCR管(N個(gè)待檢樣品+1個(gè)陰性對(duì)照+6個(gè)陽性對(duì)照),向各PCR管中分別加入下列成分(見詳細(xì)說明書,可向我司索取)

轉(zhuǎn)移至樣本準(zhǔn)備區(qū)。

四、添加模板(模板添加區(qū))

qPCR管中分別加入2ul模板,加樣順序?yàn)殛幮詫?duì)照(DEPC-H2O)、待測(cè)樣品模板、嬰兒利什曼蟲qPCR陽性對(duì)照,離心30秒,立即進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)。

五、擴(kuò)增反應(yīng)(擴(kuò)增及產(chǎn)物分析區(qū))

PCR管放置在PCR擴(kuò)增儀器樣品槽相應(yīng)位置,進(jìn)行擴(kuò)增,擴(kuò)增程序如下(見詳細(xì)說明書,可向我司索取)

 

六、結(jié)果分析

1. 如果制作標(biāo)準(zhǔn)曲線,則以陽性對(duì)照濃度的log 值為橫軸,以Ct 值為縱軸,繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。再以待測(cè)樣品的Ct 值從標(biāo)準(zhǔn)曲線上推算出樣品DNA 濃度的log 值,推算出其濃度。

2. 如果未制作標(biāo)準(zhǔn)曲線,按照如下標(biāo)準(zhǔn)判定結(jié)果:

陽性對(duì)照結(jié)果:Ct 值<30,有明顯指數(shù)增長(zhǎng),呈典型的S 型曲線。

陰性對(duì)照結(jié)果:Ct 值>38 或無Ct 值,無明顯指數(shù)增長(zhǎng)期和平臺(tái)期。

樣本檢測(cè)結(jié)果:Ct 值<35,有明顯指數(shù)增長(zhǎng),表明樣本中檢測(cè)出嬰兒利什曼蟲,結(jié)果為陽性;Ct 值>38 或無Ct 值,表明樣本中未檢測(cè)出嬰兒利什曼蟲,結(jié)果為陰性;Ct值在35-38 范圍,應(yīng)對(duì)樣本進(jìn)行復(fù)檢,如重復(fù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果Ct 值仍在35-38 范圍,有明顯指數(shù)增長(zhǎng),則判定為陽性,否則為陰性。

 

運(yùn)輸及保存低溫運(yùn)輸,-20℃保存,保存期限為一年。陽性對(duì)照需要單獨(dú)放置,不要污染其他試劑。

 

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